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大家都知道，基因芯片技术是促进医学研究最为成熟、高效的手段之一。最近，欧易客户，上海交大医学院的郝旻罡老师与复旦大学肿瘤研究所的王建华老师等合著的一篇文章发表在了JPathol杂志，研究采用了AgilentSurePrintG3HumanGeneExpressionMicroarray8×60Kv2这款芯片。今天小编就为大家带来这篇文章的简单解读，看一看我们的客户是如何利用芯片进行研究的。
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背景介绍前列腺癌（Prostatecancer，PCa）是西方国家男性最常见的恶性肿瘤。虽然PCa不是中国男性最普遍的肿瘤，但其发病率和死亡率近年来都快速增长。大多数PCa相关死亡的主要原因在于其侵袭性（Invasive）和转移性（Metastatic），多项研究已经确定了与之相关的几种分子改变，包括PTEN的丢失或突变、TMPRSS2:ERG基因融合、TP53突变、NKX3-1的下调以及MYC和CXCR4的上调。虽然系统治疗方法降低了癌症特异性死亡率，但PCa仍然表现出高转移率。因此，解析PCa转移的分子机制成为改善治疗效果的关键。
上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT），在此期间细胞从非移动的上皮表型转变为高度移动的间质表型，被广泛认为是原发性肿瘤发展为转移型的关键步骤。EMT的标志性事件是E-钙粘蛋白的部分或完全丧失，不仅破坏了上皮细胞之间的相互作用，而且引起了EMT负责的广泛的转录和功能变化。一些EMT诱导的转录因子，包括Zeb1，Zeb2，Snail和Slug，已被确定为E-钙粘蛋白的直接转录阻遏物，这些转录因子的表达水平升高与侵袭性PCa相关。
HIC1是位于染色体17p13.3上的肿瘤抑制基因，在许多类型的人类恶性肿瘤（包括乳腺癌，肝癌，结肠直肠癌，肺癌和胃癌）中常出现CpG岛高甲基化。其他一些调节机制也涉及调节HIC1的功能和表达，例如SIRT1的acetylation-SUMOylation转换和p53、E2F1的正向转录调控。虽然Hic1纯合子破坏的小鼠在胚胎发生期或围产期死亡，但是具有该基因杂合缺失的小鼠发展出各种恶性肿瘤。HIC1编码序列特异性转录抑制物，属于BTB/POZ和C2H2锌指家族。HIC1的N-末端BTB/POZ结构域负责蛋白质与蛋白质的相互作用，而C-末端区域以核心基序GGCA结合到具有名称为HiRE（HIC1响应元件）的特异性DNA序列。HIC1的几种下游靶基因已被鉴定，涉及调节血管生成、增殖、细胞周期和转移，包括CXCR7、LCN2、SIRT1、ATOH1、CCND1和P57KIP2。然而，HIC1受损在调控PCa转移中的作用和机制在很大程度上仍是未知的。
文章结果转移性疾病是前列腺癌导致死亡的主要原因，虽然已经观察到HIC1（甲基化的癌症）基因在PCa中被表观修饰，但其在PCa转移中的内在作用和机制仍然不确定。
该文研究表明，与原发性和相邻的正常前列腺组织相比，HIC1启动子的超甲基化显著降低其在转移性PCa组织中的抑制功能，并且与患者的低存活率相关。作为上皮-间质转化的结果，前列腺癌易患小鼠中，靶向Hic1敲除的前列腺癌表现出比杂合动物更强的转移行为。此外，PCa细胞中HIC1表达的损伤通过增强Slug和CXCR4的表达（这两者对PCa转移至关重要），透过EMT诱导PCa细胞的迁移和扩散；CXCL12/CXCR4通过激活ERK1/2通路促进EMT。总之，该文研究结果表明，HIC1/CXCR4/Slug信号的评估可能用于PCa侵袭性的预测。
PCA中的HIC1缺失与转移表型有关与HIC1表达较高的PCA患者相比，Kaplan-Meier分析显示早期根治性前列腺切除术后复发率较高（图1A）。值得注意的是，与初级和相邻的正常前列腺组织相比，HIC1表达仅在转移性PCa组织中显着降低（图1B）。这些数据表明HIC1表达与PCa转移密切相关，可作为PCa侵袭性的病理预测因子。
图1
PCA中的HIC1损失与转移表型和患者低生存率有关。C：免疫组织化学分析；D：HE染色；E：ɑ-SMA染色。
HIC1缺失通过EMT诱导PCa转移为了探索HIC1的损失如何促进PCa转移，HIC1在两个转移性PCa细胞系C4-2B和DU中分别稳定沉默（分别表示为C4-2Bshctrl，C4-2BshHIC1-2，C4-2BshHIC1-3和DUshctrl，DUshHIC1-2，DUshHIC1-3）。两种细胞中沉默HIC1表达增强了其迁移和侵袭能力。为了进一步探讨HIC1是否在体内调节PCa转移，作者通过逆转录病毒感染用荧光素酶基因标记了DUshctrl和DUshHIC1，然后通过心内注射将这些标记的细胞移植到BALB/c裸鼠中。与体外测定一致，HIC1沉默极大地促进了DU细胞的转移潜能（图2A，腹侧成像），使用C4-2Bshctrl-shctrl和C4-2BshHIC1-shctrl细胞也观察到类似的结果（图3C和3D）。此外，生物发光成像证实，在携带C4-2BshHIC1-shctrl的小鼠中，在注射后6周时携带C4-2Bshctrl-shctrl细胞的小鼠的骨转移发生率更高（图3E）。骨质破坏是PCa患者发病的主要原因[2]。与对照组相比，放射照相分析和H＆E染色进一步证实，接种C4-2BshHIC1-shctrl和DUshHIC1细胞的小鼠显示骨髓中明显的骨破坏和定植肿瘤细胞（图2B和2C）。另外，用C4-2BshHIC1-shctrl细胞接种的小鼠的寿命比C4-2Bshctrl-shctrl的寿命短（图3F）。免疫荧光染色（图2E）进一步证实了E-钙粘蛋白的表达降低和波形蛋白或N-钙粘蛋白在C4-2BshHIC1细胞中的表达增强。
图2
HIC1缺失通过EMT诱导PCa转移
与HIC1缺失有关的EMT同样与Slug有关HIC1沉默显着增加了Slug的表达，但对Snail和ZEB1/2没有影响（图3A）；C4-2BshHIC1细胞中的猝死显著逆转HIC1损失引起的EMT（图3B）；Slug沉默显着增加了小鼠的存活率（图3F）。这些结果表明，Slug通过由HIC1缺失启动的EMT在PCa转移中起重要作用。
图3
Slug涉及HIC1缺失的EMT。
Slug基因受HIC1的直接调控在两种细胞系中，HIC1表达显着抑制了Slug启动子活性（图4A）；涉及HIC1介导的抑制的调节区可能位于-bp至+10bp的区域（图4B）；两种突变的构建体显着降低HIC1的抑制能力（图4C）；图4D显示，Slug启动子富集来自C4-2B和DU细胞的HIC1免疫沉淀的染色质，但不存在由对照兔IgG免疫沉淀的染色质。总之，这些数据证实HIC1直接抑制了Slug。
图4
Slug基因被HIC1直接抑制。
HIC1调控CXCR4在PCa中的表达C4-2B和LNCaP细胞中的HIC1敲低显着增强了CXCR4的表达（图5A）；携带PCa的PtenPC-/-Hic1PC-/-小鼠比PtenPC-/-Hic1PC+/-小鼠表现出更强的Cxcr4表达（图5B）；HIC1抑制作用仅被Δ1构建体解除，这表明CXCR4启动子中推定的第一个HiRE位点对于HIC1介导的抑制是必需的（图5D）。这些发现表明，HIC1通过直接靶向其启动子来调节CXCR4表达，并且潜在地与PCa骨转移相关。
图5
HIC1调控CXCR4在PCa中的表达。D：免疫沉淀的染色质
CXCL12/CXCR4axis调节EMT过程流式细胞术检测证实了CXCR4在C4-2B细胞中的过度表达（图6A）；CXCR4的过度表达显着增强了Slug，N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达，随后E-cadherin的表达降低（图6B）；CXCR12/CXCR4axis与Akt、ERK1/2、STAT3信号通路的激活有关（图6C）；HIC1沉默激活Akt、ERK1/2、STAT3通路（图6D）。
图6
通过激活ERK1/2途径，CXCL12/CXCR4axis可以调节Slug表达。F：HIC1表观遗传沉默对PCa转移的影响。
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